ELISpot是一種用于定量分泌某種特定靶標分析物細胞的免疫測定方法。整個刺激過程中細胞分泌的細胞因子、抗體或其他靶蛋白在分泌后會立即被特異性抗體捕獲，這種即時捕獲使ELISpot成為一種在單細胞水平上極其靈敏的檢測方法。

細胞在刺激存在或不存在的情況下，在包被有特異性捕獲抗體的膜孔中進行培養(yǎng)，因此，細胞分泌的目標蛋白會被立即捕獲。經(jīng)過適當?shù)臅r間孵育后，取出細胞，使用檢測抗體檢測分泌的靶標分析物。加入染色底物后，最終在膜表面上出現(xiàn)可見的斑點。每個點對應一個單獨的分泌目標蛋白質的細胞。

圖1.ELISpot檢測示意圖

想要做好ELISpot實驗，從最開始包被抗體到最后檢測的每個實驗細節(jié)都需要注意。大家往往可能會忽略一個細胞處理的細節(jié)步驟，即細胞靜置步驟。該步驟有可能會顯著影響ELISpot實驗的準確性。下面Mabtech帶我們深入了解一下為什么細胞靜置這一步至關重要，以及如何正確完成。

ELISpot分析非常靈敏，能夠檢測到分泌靶標分析物的單個細胞，但實際情況中有可能非實驗性體內(nèi)刺激或分離細胞過程中的攪動會使細胞自發(fā)分泌高水平的靶標分析物，如細胞因子或抗體，導致檢測結果失真。ELISpot檢測前的細胞靜置步驟有助于確保細胞處于自然、未受刺激的狀態(tài)，從而更準確地反映其正常的靶標分析物分泌水平。靜置細胞的另一個重要作用是去除細胞碎片，確保更干凈的背景。

如何進行細胞靜置處理呢？

1.分離細胞:首先分離好實驗所需的PBMCs、T細胞、B細胞或其他免疫細胞。

2.調(diào)整細胞密度:在分離和洗滌細胞后，測量細胞活力，并將細胞密度調(diào)整到適合靜置的水平。通常，細胞密度約為每ml培養(yǎng)基1-2百萬個細胞。Mabtech建議將細胞放在50ml或15ml的無菌錐形管中，并稍微擰松蓋子，以便在培養(yǎng)時進行氣體交換。

3.靜置細胞:在37℃、含5% CO2的無菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細胞。讓細胞靜置至少一個小時，或者過夜。最佳靜置時間可能因細胞類型和檢測的具體情況而異，需要進行一些優(yōu)化。

4. 靜置期結束后，輕輕地重懸細胞，讓一些結塊的細胞碎片落到試管底部。避免結塊漂起，將細胞懸液轉移到一個新的50 ml試管中進行洗滌步驟。

5.離心洗滌細胞，倒出上清液。重新懸浮在新鮮培養(yǎng)基中，并重復一次洗滌步驟。

6.  再次檢測細胞活力，并將細胞數(shù)量調(diào)整到ELISpot檢測所需的適當水平。

溫馨提示：本文中的實驗步驟僅供參考，實驗時請按照產(chǎn)品說明書操作。

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